FLIM系統(tǒng)是如何進行工作的？

熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)是一種用于研究和測量生物分子的熒光壽命的技術(shù)，因其可以用于無標記成像，具有快速響應(yīng)時間，可通過高分辨率成像技術(shù)（如共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡）結(jié)合使用等特點，近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學研究和生命科學等相關(guān)領(lǐng)域。那么，F(xiàn)LIM是如何實現(xiàn)如此強大的功能呢？

FLIM的首要任務(wù)就在于測量熒光壽命(Fluorescence lifetime, FL)，待測物體被一束激光激發(fā)后，該物體吸收能量后，從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)上，再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光并回到基態(tài)。將激發(fā)光關(guān)閉后，分子的熒光強度也將隨時間逐漸下降。

假定一個無限窄的脈沖光（δ函數(shù)）激發(fā)n0個熒光分子到其激發(fā)態(tài)，處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和Knr，則激發(fā)態(tài)衰減速率可表示為：

其中n(t)表示時間ｔ時激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目，由此可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程：

n (t) = n0 exp (-t / τ)

上式中衰減總速率的倒數(shù)τ＝(Γ＋Knr)-1即為熒光壽命。熒光強度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù)，因此可將上式改寫為:

I (t) = I0exp (-t / τ)

該式中，I0即為分子受激發(fā)時的最大光強。我們將該熒光強度下降至激發(fā)時的熒光最大強度I0的1/e（約37％）所需要的時間，稱為熒光壽命。

圖1 熒光壽命曲線示意圖

對于測量熒光壽命的方式可大致分為以下兩種，頻域法與時域法。而時域法還可進一步分為門控法、條紋相機法與TCSPC法（Time-Correlated Single Photon Counting, 時間相關(guān)單光子計數(shù)）。目前，應(yīng)用最為廣泛的是TCSPC法，其基本原理是在一個極短的時間窗口內(nèi)精確測量單個光子的到達時間。當激光或其他光源激發(fā)樣品時，樣品會發(fā)射熒光光子。這些光子傳播到檢測器，其中每個光子的到達時間都被記錄下來。記錄到達時間的數(shù)據(jù)可以被用來創(chuàng)建熒光壽命的時間衰減曲線，該曲線描述了熒光光子的時間分布。通過分析這些時間分布，可以獲得關(guān)于樣品的信息，如熒光壽命、發(fā)光光譜和熒光量子產(chǎn)率。其基本原理是測量光子到達探測器的時間。當一個光子被探測到時，會觸發(fā)一個計數(shù)器，記錄光子到達的時間。通過多次測量并記錄光子到達的時間，可以生成光子到達時間的分布曲線，如圖2所示，從而獲得有關(guān)樣品的信息。

圖2 TCSPC原理示意圖

TCSPC系統(tǒng)具有非常高的時間分辨率，通常在皮秒（ps）級別。這使得它能夠精確測量光子到達時間，即使在非常短的時間尺內(nèi)也能實現(xiàn)準確的測量，且可以處理極低光子計數(shù)的數(shù)據(jù)。基于統(tǒng)計分析的TCSPC法避免了熒光強度的直接測量，因而信噪比較高，探測效率近乎理想。但由于通常需要多次重復掃描來為每個像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命，成像時間通常會較長。因此，如何提高成像速度與測量精度成為了人們關(guān)注的重點。近些年來，隨著超快激光技術(shù)、高速高靈敏探測技術(shù)以及圖像處理技術(shù)等相關(guān)技術(shù)發(fā)展，為開發(fā)廉價、高性能、多功能的熒光壽命成像系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。

圖3 FLIM系統(tǒng)示意圖

上海昊量光電新推出了意大利FLIM LABS公司的熒光壽命成像FLIM入門套件系統(tǒng)，專門為追求單光子FLIM成像和熒光壽命光譜應(yīng)用而設(shè)計，能為您帶來高性能、高性價比的FLIM解決方案。該套件包括熒光壽命成像FLIM數(shù)據(jù)采集卡TDC、光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊、SPAD單光子探測器與熒光壽命成像FLIM軟件，并在您需要時提供恒比鑒相器模塊。

圖4 FLIM LABS的熒光壽命成像FLIM入門套件

FLIM數(shù)據(jù)采集卡TDC：

我們的緊湊型 USB 供電數(shù)據(jù)采集卡專為熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計。其基于FPGA的可定制技術(shù)，尺寸101x139x28mm，重量輕（僅120克），總計26個I/O通道可分辨熒光壽命50ps，死區(qū)時間1.5 ns，計時精度（σ/√2）300ps，24 或 48 ps 時間 bin 分辨率，并能通過USB3.0與PC軟件直接連接，無需額外供電。

光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊：

我們的激光器模塊可用波長有405、445、488、520、635 和 850 nm，譜寬±10nm，獨立模塊，無需連接電腦。脈沖持續(xù)時間低至 50ps (FWHM) ，單模光纖耦合（FC/PC），150mW脈沖峰值，功率80MHz 時平均 CW 功率為 1.5mW，提供外部和內(nèi)部數(shù)字同步觸發(fā)。

SPAD單光子探測器：

我們的 USB 供電光纖耦合單光子 SPAD 探測器專為時間分辨熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計。尺寸?。?00x60x30mm）且重量輕（235g），可通過 USB 供電，光譜響應(yīng)范圍從 370nm 到 900nm，7 cps 暗計數(shù)，抖動小于200ps。 

熒光壽命成像FLIM軟件：

我們的FLIM Studio軟件旨在簡化熒光壽命光譜和成像實驗的數(shù)據(jù)采集、重建和分析。該環(huán)境提供了用戶友好的界面和任何用戶都可以使用的直觀工具?？梢宰龅綄崟r成像和熒光衰減直方圖數(shù)據(jù)重建，實時 FLIM 相量圖分析，并人工智能驅(qū)動的相量圖分析技術(shù)，提供用于數(shù)據(jù)采集和重建的軟件 API（Rust、C、C++、C#、Python、node.js、.N ET），支持MATLAB、Python、HDF5、.SVG FLIM 相量和成像數(shù)據(jù)導出。

恒比鑒相器CFD：

我們的恒定分數(shù)鑒別器（CFD）結(jié)構(gòu)緊湊，性能好。恒比鑒相器CFD允許用戶將模擬信號（例如，來自PMT的信號、脈沖激光源的同步信號等）轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。恒比鑒相器CFD模塊非常易于使用，可以與不同的顯微鏡或光譜設(shè)置相結(jié)合。單通道雙輸出模塊，區(qū)分正負輸入信號，支持上升時間<500ps，抖動<15ps，最大重復頻率為140MHz，最小輸入可檢測信號為+/- 100mV，最大輸出信號：4V@50Ohm 。

歡迎隨時與我們聯(lián)系溝通FLIM系統(tǒng)的使用，我們會根據(jù)您的需求幫您進行權(quán)衡！

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關(guān)于昊量光電：

上海昊量光電設(shè)備有限公司是光電產(chǎn)品專業(yè)代理商，產(chǎn)品包括各類激光器、光電調(diào)制器、光學測量設(shè)備、光學元件等，涉及應(yīng)用涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫(yī)療、科學研究、國防、量子光學、生物顯微、物聯(lián)傳感、激光制造等；可為客戶提供完整的設(shè)備安裝，培訓，硬件開發(fā)，軟件開發(fā)，系統(tǒng)集成等服務(wù)。