活細胞的“聚光燈"——前沿活細胞成像的案例分享

細胞是一切生命的基本單位，構成了各式各樣的生命體。因此研究細胞的結構以及內部生命活動過程可以幫助我們更深入地探究生命的奧秘，了解生命體是如何構建和運作的。傳統(tǒng)的細胞顯微術只能通過觀察固定的細胞標本進行推測，但已經失“活"的細胞已經無法反應新陳代謝、信號傳導等生命活動，無法反應活細胞的真實情況。因此活細胞顯微術越來越受到生命科學研究學者的青睞，能夠在細胞仍然活躍并處于正常生理活動的狀態(tài)下進行觀察，幫助科學家更好地研究細胞間的相互作用，以及進行藥物研發(fā)和篩選等方面的應用。在這里，我們整理了近幾年來自Lumencor的白光光源運用于活細胞顯微術的前沿研究，希望能為您的研究帶來靈感。

細胞內部Ca2+，線粒體膜電位和細胞質乳酸的延時成像

來自威斯康星大學麥迪遜分校Sophia M. Sdao, Thuong Ho, Chetan Poudel等科學家研究了CDK2和β活細胞之間的關系，發(fā)現(xiàn)CDK2可以抑制β活細胞的氧化糖代謝和胰島素分泌，同時對β細胞的代謝信號和K(ATP)通道有重要影響。作者利用一個可誘導的β細胞特異性CDK2缺失的小鼠模型(CDK2-IKO)進行研究，發(fā)現(xiàn)這種小鼠的葡萄糖耐受性和葡萄糖刺激的胰島素分泌都有所提高。實驗中通過多種方法測量了CDK2-IKO小鼠的β細胞電活性、鈣信號、NAD(P)H熒光壽命、乳酸水平和線粒體膜電位。在搭建延時成像生物傳感器時，采用Lumencor SOLA SEII 365作為熒光激發(fā)光源，并且基于Lumencor精確的電子控制系統(tǒng)，可以快速調節(jié)光輸出的強度，設置為<20%的功率輸出。

參考文獻

Sdao S M , Ho T , Poudel C ,et al.CDK2 limits the highly energetic secretory program of mature β cells by restricting PEP cycle-dependent KATP channel closure[J].Cell Reports, 2021, 34(4):108690.DOI:10.1016/j.celrep.2021.108690.

HuH-7人肝癌細胞中GFP表達的20小時延時成像

非病毒基因遞送是基因治療領域的一個快速發(fā)展的研究課題，其低免疫原性避免了免疫系統(tǒng)對外源基因的排斥和攻擊，提高了基因治療的安全性和有效性，但受到合成核酸納米載體在內吞體內停留時間的限制。為了克服這種瓶頸，需要一種能夠同時測量納米載體的攝取動力學和轉染效率的方法。慕尼黑大學的研究人員A. Reiser, D. Woschée, N. Mehrotra等人使用單細胞陣列的活細胞成像(LISCA)來研究不同血清條件下基于脂質mRNA復合物的遞送時間分布，文中使用HuH-7肝癌細胞作為系統(tǒng)模型（RNA治療的主要靶器官之一）。該方法可以同時監(jiān)測數(shù)百個單細胞的eGFP報告基因表達，通過擬合到模型，即可得到每個單細胞的表達起始時間和表達速率等參數(shù)。本文采用微結構單細胞陣列和自動活細胞延時顯微鏡來收集單個熒光時間過程。其中用于延時成像的時間分辨熒光顯微鏡搭載的即是來自Lumencor的SOLA-SE II LED光源。

參考文獻

Reiser A ,D Woschée, Mehrotra N ,et al.Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection[J].Integrative Biology, 2019, 11(9).DOI:10.1093/intbio/zyz030.

用高通量多色熒光顯微鏡觀察單個大腸桿菌細胞雙鏈斷裂修復

來自瑞典烏普薩拉大學和皇 jia理工學院的研究人員Wiktor J, Gynn? A H, Leroy P等在Nature上發(fā)表了一篇探索活細菌中RecA螺旋絲如何通過同源重組修復雙鏈DNA斷裂（DSB）機制的文章。在一個可誘導的DSB系統(tǒng)中，利用高通量、微流控和熒光顯微技術，直接觀察大腸桿菌中DSB修復的過程，以及RecA蛋白在修復中的動態(tài)變化，如下圖中所展示的。

在搭建實驗所用的熒光顯微鏡時，Lumencor的Spectra III 系列的熒光光源與Nikon的Ti2-E倒置顯微鏡以及Andor的Sona 4.2B-11 scmos相機組合使用。顯微鏡由運行內建插件Micro-Manager控制。而熒光光源由相機通過TTL連接觸發(fā)，使用電子快門控制。Lumencor的TTL觸發(fā)輸入可以外部控制集成的八個光源的選擇以及開關，憑借精確的電子控制，切換速度間隔可達10μs。

參考文獻

Wiktor J, Gynn? A H, Leroy P, et al. RecA finds homologous DNA by reduced dimensionality search[J]. Nature, 2021, 597(7876): 426-429.

基因編碼電壓指示劑 （GEVI） JEDI-1P 在解離的大鼠皮質和海馬神經元中的成像

使用基因編碼的電壓指示劑（GEVI）進行寬場成像是了解大型皮層網絡在神經編碼行為中的作用的一種有前景的方法。萊斯大學以及埃默里大學的研究人員開發(fā)了一種針對單光子成像優(yōu)化的GEVI和改進的方法，應用于小鼠長期的全腦電壓成像。并通過一個自動化高通量篩選平臺，使其具有快速的動力學、高亮度、高靈敏度和在寬常單光子照明下的高光穩(wěn)定性。在多輪定向進化后，產生了在所有指標上都有所提高的JEDI-1P，這是一種綠色的熒光指示劑，zui終研究人員成功在清醒小鼠中實現(xiàn)了穩(wěn)定的全腦電壓成像。

為了以高通量的方式評估GEVI的性能，研究人員搭建了一個基于倒置顯微鏡（A1R-MP,Nikon Instruments）自動化多模式的96孔篩選平臺。由Lumencor的LED光引擎（SpectraX）產生激發(fā)光，通過液態(tài)光波導（LLG）引導至顯微鏡的熒光頂置照明器。其中青色光(中心波長/帶寬，470/24nm)和綠光(550/15nm)通過物鏡分別照射到樣品臺上，激發(fā)基于GFP的GEVI以及mCherry。

Fura-2 Ca2+在小鼠垂體細胞中的成像

為了探究蛋白酪氨酸磷酸酶受體N和N2（PTPRN和PTPRN2）在小鼠繁殖過程中的性別特異性作用機制，美國國立衛(wèi)生研究院的尤尼斯肯 ni 迪施萊佛guo家兒童健康與人類發(fā)展研究所 (Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development)的研究人員對PTPRN和PTPRN2進行雙敲除（DKO）,結果導致雌性小鼠不育，表現(xiàn)出青春期延遲、無排卵、卵巢基因表達和類固醇合成的改變。而雄性小鼠則大部分育性不受影響，睪丸的基因表達、類固醇合成以及生殖器官的發(fā)育沒有明顯影響。在研究過程中，鈣離子成像技術被用于研究垂體細胞的成像，研究PTPRN和PTPRN2的缺失對垂體促性腺激素細胞（gonadotrophs GnRH）的鈣信號的影響。340/30nm和380/20 nm的激發(fā)帶通由Retra II光引擎（Lumencor,Beaverton,OR）提供，激發(fā)帶通通過510/84nm的濾光片進行了檢測。

圖中展示了一些GnRH（100pM）誘導培養(yǎng)垂體細胞中的鈣信號數(shù)據(jù)。實驗使用源自WT和DKO雄性和雌性小鼠的細胞進行。

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